Het materiaaltechnisch onderzoek en met name infraroodreflectografie (IRR) heeft een belangrijke rol gespeeld in het kunstwetenschappelijk onderzoek dat voorafging aan de tentoonstelling Pieter Pourbus en de vergeten meesters. Een zestiende-eeuws schilderij bestaat uit verschillende lagen. Eerst wordt een gronderingslaag aangebracht, waarna de schilder een ondertekening kan aanbrengen. Daar overheen worden de verflagen geschilderd. Wanneer de tekening met een koolstofhoudend materiaal is aangebracht kan deze gedetecteerd worden door een IRR-camera. De camera registreert het gereflecteerde infraroodlicht dat door de verflagen is gegaan en door het witte paneel wordt teruggekaatst. Koolstof absorbeert de infraroodstralen en op die plaatsen wordt niets gereflecteerd. Het beeld dat de camera vastlegt is een infraroodreflectogram.
De opdrachtgevers en werkmethodes van Pieter Pourbus waren niet goed gekend. Dankzij de combinatie van de studie van de voorbereidende tekeningen op papier (o.a. Laatste Oordeel, Van Belle-vidimus en de voorstudie met het medaillon voor de Van Belle-triptiek), de studie van de ondertekening en de verflagen, werd er veel kennis vergaard over het werkproces. Pourbus blijkt zeer systematisch te werken, met de ondertekening als belangrijke voorbereiding op de schilderfase. In het geval van het Laatste Oordeel heeft de ondertekening waarschijnlijk als controlemiddel gediend voor de opdrachtgever. Dit kan worden afgeleid uit enerzijds een meer uitgewerkte ondertekening dan anders. En anderzijds uit een opschrift van 19 Franse woorden in humanistisch cursief (de woorden zijn niet te ontcijferen), dat in de lucht onder de verflagen is teruggevonden. Het is zeer onwaarschijnlijk dat Pourbus dit zelf heeft aangebracht. Waarschijnlijk zijn ze van de hand van de opdrachtgever tijdens een bezoek aan het atelier. Pourbus probeerde later het opschrift uit te vegen. De ondertekening verraadt iets over de relatie met de opdrachtgever.
De ondertekening van de Van Belle-triptiek leidt ons stap voor stap door de opbouw van het schilderij. Pourbus tekende eerst een kwadraatnet en gebruikte de kruispunten van de lijnen als oriëntatiepunten voor de architectuur en de passer waarmee hij de medaillons tekende. Voor de medaillons gebruikte hij twee doorgeprikte cartons, op die manier kon hij zeer eenvoudig meerdere keren exact dezelfde vorm herhalen. Opnieuw een zeer systematische en doordachte werkwijze.
Zo’n kijkje in de interne keuken is zeer leuk, maar het belangrijkste resultaat van het onderzoek naar de ondertekening is het nieuwe inzicht in Pourbus’ opleiding. Bij gebrek aan kennis over de opleiding van Pourbus is meermaals gesuggereerd dat hij door Van Scorel in Utrecht opgeleid werd. De ondertekening vertoont nochtans geen overeenkomsten met de ondertekening van deze meester. Er zijn wel veel overeenkomsten te herkennen in de werkwijze van de Leidse meesters Lucas van Leyden en Cornelis Engebrechtsz. Zij overleden toen Pourbus nog jong was, maar het is goed denkbaar dat hij in de leer ging bij één van de zonen van Cornelis Engebrechtsz.: Pieter Cornelis Kunst (ca. 1490-1560/1561), Cornelis Cornelisz. Kunst (ca. 1493-1546) en Lucas Cornelisz de Cock (ca. 1495-vóór juni 1552).